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Metodi per rilevare anticorpi del PRRSV
L'immunofluorescenza indiretta (IFA), la neutralizzazione del virus nel siero (SVN), l'immunoperossidasi in monostrato (IPMA) e l'immunoassorbimento enzimatico (ELISA),sono utilizzati per il rilevamento degli anticorpi specifici vs il PRRSV. Attualmente, IFA, SVN ed ELISA si possono realizzare nella maggior parte dei laboratori di diagnostica veterinaria del Nordamerica, mentre in Europa si utilizza molto IPMA.Tutte le prove si considerano specifiche con differenti gradi di sensibilità. Generalmente IFA, ELISA e IPMA servono per rilevare anticorpi totali dell'isotipo IgG specifico per PRRSV, mentre la SVN si utilizza per rilevare anticorpi funzionali associati all'immunità o protezione immunitaria. IFA ed ELISA sono state adottate per rilevare altri isotipi, come IgM o IgA (Figura 1). Gli anticorpi IgG specifici per PRRSV, che si possono rilevare mediante IFA, IPMA o ELISA, si producono in suini infettati tra i giorni 7 e 14 dopo l'infezione; tuttavia, gli anticorpi SVN possono essere rilevati anche da 1 a 2 mesi dopo l'infezione (Figura 2). Generalmente, gli anticorpi contro il PRRSV di infezioni attive si possono rilevare in maniera precisa da 3 a 4 mesi dopo l'infezione e possono durare da 6 mesi fino ad 1 anno dopo lo scoppio dell'episodio.
Figura 1. Risposta delle IgM in suini giovani dopo una infezione sperimentale con PRRSV, misurata con IDEXX PRRS ELISA 2XR con modificazioni. I gruppi 1 e 2 furono inoculati con PRRSV tipo 2 per via intranasale il giorno 0. Il gruppo 1 fu reinoculato a 196gg post-inoculazione (dpi), mentre il gruppo 2 no. Il gruppo 3 non fu inoculato con PRRSV fino a 196 dpi. Gli anticorpi IgM specifici per PRRSV si possono rilevare a partire da 7 dpi e diminuiscono rapidamente dopo 14 dpi. (Nezami S and Yoon KJ, dati non pubblicati)
Figura 2. Risposta degli anticorpi specifici vs il PRRSV durante un periodo di tempo dopo l'infezione sperimentale in suini, misurata mediante la prova di immunofuorescenza indiretta (A), test di immunoperossidasi in monostrato(B), prova di neutralizzazione del virus nel siero (C) e test d'immunoassorbimento enzimatico (D). (Adattato dalla di Yoon K-J, et al.: Characterization of the humoral immune response to PRRSV infection. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 7:305-312, 1995)
Nei test IFA e IPMA si utilizza come antigene cellule infettate dal virus (figura 3). Un vantaggio di queste prove rispetto ad ELISA è che si può determinare il titolo degli anticorpi. Tuttavia, i criteri di valutazione dei titoli degli anticorpi IFA spesso variano tra tecnici e laboratori dato che l'interpretazione è soggettiva. Inoltre, i risultati della prova o i criteri di valutazione dei titoli anticorpali variano dipendendo dal grado nel quale il ceppo di PRSV utilizzato differisce antigenicamente dal ceppo che causa l'infezione.
Figura 3. Fotomicroscopica ad immunofluorescenza positiva in un monostrato di cellule MARC145 infettate da PRRSV, incubate con siero suino che contiene anticorpi IgG specifici per PRRSV e tinta con anticorpi di capra anti-IgG di suino coniugati con FITC.
Si crede che l'ELISA sia più sensibile di IFA e IPMA. Sono stati descritti vari formati di ELISA: un ELISA indiretta che utilizza un quoziente campione/positivo (M/P), un ELISA indiretta che utilizza valori di DO diretti ed una ELISA di bloccaggio. Attualmente ci sono vari kits di ELISA commerciali disponibili per rilevare anticorpi sierologici specifici per il PRRSV (figura 4). L'uniformità nella fabbricazione del kit e l'alto grado di automatizzazione nella realizzazione della prova nel laboratorio diagnostico danno luogo a minori variazioni nei risultati del kit commerciale di ELISA rispetto agli altri test. Altri vantaggi del kit commerciale sono: a) la rilevazione di anticorpi contro entrambi i tipi di PRRSV; b) il tempo di risposta rapido; e c) autorizzazione. Ultimamente il sistema ELISA si è anche adattato all'analisi dei campioni di fluidi orali per rilevare anticorpi del PRRSV come parte della vigilanza in allevamento.
Figura 4. Fotografia di una placca IDEXX ELISA X3 che mostra risultati positivi(color blu) e negativi(senza colore).La densità del colore è correlata con il livello di anticorpi nel siero, ovvero, quanto più scuro è il colore, più alto è il titolo anticorpale.
(Foto cortesia di: Dr. David Baum, Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory)
La prova SVN anch'essa si considera una prova aspecifica, però studi antecedenti hanno suggerito che SVN è meno sensibile di IFA ed ELISA. La bassa sensibilità della prova si deve principalmente al fatto che gli anticorpi neutralizzanti contro il PRRSV si sviluppano lentamente e tardivamente. Essendo una prova laboriosa, è meglio considerare SVN come uno strumento di investigazione e non come una prova diagnostica di routine. Come succede con IFA e IPMA, i risultati di SVN sono molto influenzati dal grado di correlazione antigenica tra il ceppo usato nella prova ed il ceppo causante l'infezione.
Interpretazione dei risultati sierologici nella diagnosi di PRRS
La sierologia è utile per confermare la presenza (ovvero, la sieropositività) e lo stato (per esempio, alti livelli anticorpali in infezioni recenti) dell'infezione da PRRSV in allevamento. L'informazione sierologica a partire da un solo campione non serve per diagnosticare PRRS clinica in un solo animale, dato che l'infezione da PRRSV ha una prevalenza molto alta negli allevamenti di suini. Nell'interpretare i risultati sierologici nei suini giovani si deve considerare la possibile presenza di anticorpi materni. E' importante anche tenere in considerazione che i test sierologici attuali utilizzati nella diagnostica non possono differenziare in maniera routinaria tra gli anticorpi indotti da vaccini e gli anticorpi indotti da ceppi di campo. Inoltre, è stata registrata la presenza di possibili falsi positivi da PRRSV incluso con kits commerciali di ELISA. Un risultato sierologico negativo alla PRRS da campioni in un particolare momento temporale ha diverse interpretazioni possibili, come : a) I suini non sono infettati dal virus; b) I suini si sono infettati recentemente con il virus e tuttavia non hanno sieroconvertito; c) I suini si sono infettati con il virus, però si sono sieronegativizzati; e d) Il risultato è stato negativo a causa della bassa sensibilità del test o ad un errore di laboratorio. Pertanto, se si usa un solo campione spot, la sierologia della PRRS deve essere utilizzata assieme ad altri metodi di campionamento validi per determinare se un allevamento è stato esposto al PRRSV e non per determinare se un animale è infetto.
Per determinare lo stato di infezione da PRRSV di un allevamento si suole raccomandare l'analisi dei suini giovani, al posto dei riproduttori. In allevamenti a ciclo chiuso, in un solo sito, la sieroprevalenza dell'infezione da PRRSV si considera generalmente più alta che in quelli di solo ingrasso-finissaggio. Normalmente, il siero di 10 suini all'ingrasso è sufficiente per determinare se l'allevamento è stato esposto al PRRSV. Nei sistemi di produzione multisede, ogni fase produttiva rappresenta una sola popolazione, pertanto ogni sito deve essere campionato. Il prelievo di una serie di campioni di sangue nelle diverse fasi di produzione è molto utile per determinare l'età nella quale l'infezione da PRRSV è più frequente.
La diagnosi sierologica dell'infezione da PRRSV, come causa di un insuccesso riproduttivo o malattia respiratoria, si può raggiungere dimostrando la sieroconversione con un paio di campioni di siero o una variazione nei titoli anticorpali (ovvero, l'innalzamento dei titoli anticorpali) in un paio di campioni di siero. Comunque, le scrofe possono essere state esposte al virus 2 o più settimane prima della comparsa dei segni clinici, nel qual caso può darsi che non si osservi l'aumento dei titoli anticorpali. La presenza di anticorpi da PRRSV nei fluidi fetali e nel sangue raccolto da suinetti nati morti e suinetti debilitati prima che ingeriscano colostro, è anch'essa indicativa di una infezione da PRRSV. Tuttavia, una valutazione diagnostica definitiva della PRRS rispetto alla malattia clinica richiede che le informazioni sierologiche siano interpretate assieme ai risultati di altri test virologici.
