0
I sintomi clinici dell'infezione dal virus della PRRS (PRRSV) possono esser diversi, per cui è necessaria la conferma di laboratorio. I tests più frequenti sono: ELISA e RT-PCR, che rilevano anticorpi specifici per il PRRSV e l'acido nucleico virale, rispettivamente.
La scelta del metodo diagnostico più idoneo dipende dall'obiettivo della diagnosi. Per il monitoraggio di allevamenti negativi sono di prima scelta i metodi più specifici, mentre per l'analisi del seme di verri singoli, si scelgono metodi con il massimo della sensibilità e che identifichino l'infezione il più precocemente possibile. Quando si pianifica ed applica un programma di controllo della PRRS, la cosa migliore è optare per una combinazione di ELISA e PCR, accompagnati dal sequenziamento del DNA. Il protocollo di campionamento in un allevamento deve essere personalizzato, considerando l'obiettivo della diagnosi e di come è organizzato l'allevamento. La domanda più importante è: l'allevamento è o no positivo al virus?. In questo caso si può fare un ELISA a 10-20 suini in ingrasso. L'analisi dettagliata della circolazione virale in un allevamento a ciclo chiuso o in multi sito, richiede un gran numero di campioni che rappresentino i vari gruppi di età, di tutte le fasi produttive e di tutti i siti, dato che possono avere ecosistemi indipendenti.
L'interpretazione della sieroconversione o della presenza del virus in un allevamento dove si usano vaccini vivi modificati rappresenta una sfida: (1) non ci sono vaccini "marcati" sul mercato (che possano differenziare gli anticorpi naturali da quelli vaccinali), (2) i virus vaccinali possono persistere in un allevamento vaccinato; (3) almeno durante un periodo, possono coesistere ceppi selvaggi con ceppi virali. In questi allevamenti, è necessario fare il sequenziamento del DNA ottenuti dai vari gruppi di età per comprendere completamente la circolazione virale.
L'analisi genomica mediante ELISA è facile da realizzarsi e normalmente ha una buona specificità e sensibilità quando è applicato in tutto l'allevamento. Tuttavia, il siero dei suini individuale, sopratutto gli adulti, possono dare un falso positivo. Questo fatto è considerato un problema nei monitoraggi di popolazioni negative e richiede la ripetizione del test dopo 2-3 settimane con un altro tipo di test (p.e.: IPMA, IFA o un'altro ELISA con maggior specificità), oppure un nuovo campionamento dopo 2-3 settimane. Questo aspetto dei risultati dei test ELISA raramente si prende in considerazione nella valutazione dei metodi diagnostici. La scarsa sensibilità di un test ELISA, in concreto, può essere compensato aumentando il numero dei campioni analizzati, mentre la scarsa specificità richiede sempre altri tipi di valutazione.
In genere, qualsiasi test ELISA è utile per la rilevazione degli anticorpi di qualsiasi genotipo di PRRSV, però i kits che usano solamente antigeni di un genotipo, normalmente sono meno sensibili verso un altro genotipo. Ci sono kits che fanno la discriminazione della sieroconversione a seconda dei diversi genotipi, ma a causa delle reazioni crociate tra entrambi, i risultati devono essere valutati con molta attenzione. E' consigliabile realizzare la PCR per confermare la diagnosi di co-infezione in un allevamento con entrambi i genotipi.
Il test PCR rileva acidi nucleici virali in base all'unione complementare di oligonucleotidi sintetici corti (primers) ad un frammento di un determinato genoma virale, che viene amplificato in seguito mediante una reazione enzimatica. Nella maggior parte dei metodi RT-PCR il prodotto della reazione si rileva con il monitoraggio del segnale emesso dalla sonda DNA dopo essersi unito alla sequenza specifica. A causa della natura di questa reazione enzimatica, tale segnale può avvenire anche in assenza della sequenza virale, dando un risultato debolmente positivo, specialmente negli ultimi cicli della PCR.
Ellingson 2013, thesis, Iowa SU
Tuttavia, la maggior preoccupazione rispetto ai metodi RT-PCR è correlata con la diversità genetica del virus, il che può dar luogo all'accumulo di mutazioni nei nucleotidi all'interno dei frammenti del genoma nei quali si uniscono i primers e le sonde, e pertanto possono dare falsi negativi alla PCR. Una analisi comparativa dei kits RT-PCR commerciali condotta da un laboratori di referenza dell'OIE (Podgorska et al., 2015) hanno indicato che alcuni dei kits sbagliavano difronte a molti ceppi tipo 1 del PRRSV originari in maggioranza dall'Est Europa. A causa della limitata disponibilità di sequenziazioni nell'Europa dell'Est, la maggior parte dei primers e delle sonde utilizzate nei metodi attuali si sviluppavano in base ai classici ceppi del tipo 2 e tipo 1 subtipo 1, mentre, i ceppi dell'Europa dell'Est dei subtipi 2-4 sono geneticamente molto divergenti (Stadejek et al. 2013). Inoltre, alcuni di questi ceppi hanno dimostrato di essere più virulenti dei ceppi circolanti nell'Ovest e Centro Europa, pertanto dovrebbe essere riservato loro una attenzione speciale per assicurare una rilevazione precoce nel caso si propagasse.
Attualmente, non si può raccomandare alcuna analisi RT-PCR come metodo universale che permetta l'identificazione di tutti i ceppi di PRRSV con una sensibilità ottimale. Queste osservazioni pongono in rilievo la necessità di una valutazione esaustiva dei metodi utilizzati attualmente e la valutazione costante in funzione dei ceppi circolanti in ogni momento. Per fare questo, si deve creare una collezione di ceppi di PRRSV che abbracci la diversità genetica conosciuta del virus, il che in questo momento è uno degli obiettivi più importanti dei laboratori di referenza della PRRS.
