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Oggi, nonostante gli sforzi documentati per raggiungere valori di fertilità e prolificità accettabili in seguito all'inseminazione artificiale, la criosopravvivenza degli spermatozoi continua ad avere risultati insoddisfacenti, con danni cellulari che avvengono durante le procedure, relativamente datate che sono lente (8-9 h), care (necessità di centrifughe refrigerate, ecc..) producendo poche dosi per eiaculato (spesso sufficienti per sole 5-8 scrofe con 2 IA/calore). Il numero di suinetti nati rimane inferiore rispetto al seme refrigerato o puro, avendo contro la vita utile degli spermatozoi sul sito di deposizione e vicino all'ovulazione che remano contro il successo riproduttivo. Tutto questo fa sì che il seme congelato non sia un'alternativa, nonostante sia necessario per le banche di genetica e per l'export di materiale genetico.
In questo articolo vedremo un'alternativa basata sulle caratteristiche in vivo dell'eiaculato, utilizzando la prima frazione spermatica del verro, di solamente 10 ml, per congelare piccole dosi (da 0,5 ml ognuna), mentre il resto degli spermatozoi eiaculati (oltre il 75%) sono utilizzati normalmente per la produzione di seme fresco, combinando così la produzione e lo stoccaggio. La fertilità/prolificità di queste piccole dosi congelate/scongelate è accettabile se si utilizza l'inseminazione intrauterina profonda per un calore spontaneo.
Imparando dall'eiaculato
L'eiaculato suino presenta 3 frazioni che possono essere differenziate durante la raccolta: frazione spermatica (acquosa, con alcuni coaguli gelatinosi, senza spermatozoi e di circa 10-20 ml), la frazione spermatica (più densa, con spermatozoi, senza coaguli di 30-50 ml) e la post-spermatica (un'altra volta acquosa, con coaguli di circa 150-200 ml). I nostri studi mostrano che gli spermatozoi contenuti nei primi 10 ml della frazione spermatica (chiamata anche picco spermatico, che contiene il 15-20% di tutti spermatozoi, Fig 1) è più resistente alla manipolazione (dalla diluizione fino alla refrigerazione) e alla crio-preservazione rispetto agli spermatozoi che arrivano dopo. Si consideri il fatto che i primi spermatozoi sono accompagnati da una secrezione specifica (epididimo/prostata), che contiene proteine associate alla fertilità: si spiega questa maggior resistenza alla manipolazione.
Figura 1: Un tipico eiaculato di verro presenta 3 frazioni distinte, dipendendo –tra gli altri parametri– della concentrazione spermatica (rappresentata qui con una linea rossa). Il picco spermatico normalmente è contenuto nei primi 10 ml della frazione spermatica. Se si congela, il picco spermatico può produrre 20 dosi per una IA intrauterina profonda, mentre il restante (frazione spermatica) tuttavia può produrre circa 25 dosi seminali fresche per l'IA tradizionale.
Come semplificare le procedure di congelamento?
Normalmente il congelamento utilizza tutta la frazione spermatica, eliminando, per diluzione e centrifugazione refrigerate, il plasma seminale. In questo modo gli spermatozoi del sedimento si diluiscono di nuovo, vengono refrigerati e congelati, spesso in paillet da 2,5 ml o in Flat-bags da 5 ml (Fig 2). Le dosi di IA, normalmente, contengono 5.000x106 di spermatozoi, per cui, un eiaculato produce al massimo 16 dosi in inseminazione cervicale (ossia, 8 scrofe contando 2 IA per calore). Abbiamo confrontato il seme congelato della frazione spermatica (controllo) con quello del picco spermatico dei primi 10 ml della frazione spermatica, utilizzando il congelamento tradizionale (CT) con una procedura semplificata (CS). Il seme del picco spermatico si usò ad una concentrazione di 900x106 spermatozoi/dose) per un'eventuale uso in IA intrauterina profonda (1-2 dosi per calore, sufficiente per 10 scrofa). Le cellule del picco spermatico sono state mantenute durante 30 minuti nel proprio plasma seminale e dopo, senza centrifugazione (ossia, senza estrarre il plasma seminale), sono state diluite con lattosio e tuorlo d'uovo (LEY, in inglese) e, durante 1,5 h, sono state refrigerate per raggiungere i + 5°C, prima di mescolarle con il LEY+glicerol (3%) e OEP (Orvus ES Paste, un detergente sintetico) e sono state imballate in Mini Flat-bags da 0,5 ml (Fig 2). Il congelamento ha utilizzato in tutti i casi una velocità di raffreddamento di 50°C/min. La procedura semplificata completa (CS) duró 3,5 h contro le 8 ore dal congelamento tradizionale; entrambi hanno avuto una crio-sopravvivenza ugualmente soddisfacente (oltre il 60% delle cellule manipolate).
Figura 2: Rappresentazione schematica delle principali differenze tra le mini-paillet in plastica da 0,25 ml, con Flat-bags simples (5 ml) e multiple (da 0,5-0,7 ml). A destra viene presentata una fotografia di un Flat-bag riempito e sigillato), cortesia del Dr Fernando Saravia).
Quali vantaggi?
Varie: usando questo protocollo semplificato e più breve, non è necessario l'uso di centrifughe refrigerate. Inoltre, la variazione intra maschio si minimizza usando spermatozoi della prima porzione (P1) che non solo sono i "migliori" per la crioconservazione, ma anche perchè si usa parte della frazione spermatica dove sono, già documentate, presenti le proteine associate alla fertilità. Infine, questa procedura libera il restante degli spermatozoi raccolti (75-80% del conteggio totale) per un procedimento aggiunto di circa 25 dosi per l'inseminazione tradizionale (Fig 1). Questa procedura semplificata dovrebbe essere un'alternativa interessante per i centri verri - usando lo stesso eiaculato - per congelare il seme suino per futuro ripopolamento o distribuzione commerciale di dosi per inseminazione tradizionale con seme fresco del restante dell'eiaculato. Questo processo non interferisce con la routine di gestione dei verri o del loro eiaculato.
Però, queste dosi così piccole (0,5 ml, 500x106 spermatozoi) sono fertili?
Sì, accettabilmente fertile, anche dopo una singola dose di seme in IA intrauterina in un calore spontaneo. La doppia inseminazione intrauterina profonda (a 24 e 36 ore dopo la rilevazione del riflesso di immobilità) eseguita in 120 scrofe (di 2°parto) con seme del picco spermatico congelato, come descritto sopra (CS), ha prodotto il 42% di parti con 8 suinetti vivi per figliata. Le dosi complementari di liquido seminale (2,3 x 109 spermatozoi) hanno prodotto l'80% di parti, con 13 suinetti vivi per figliata (M Wallgren, risultati non pubblicati). Nonostante non sia un'alternativa al seme liquido per uso commerciale, questa tecnica di congelamento è una buona opzione per le banche genetiche e i controlli di biosicurezza senza interferire nella produzione di dosi commerciali liquide o nella gestione dei verri.
