Guida pratica per il prelievo di campioni di fluidi orali

Le recenti pandemie (COVID-19 negli esseri umani e peste suina africana nei suini) hanno confermato l'importanza delle informazioni sulla popolazione per comprendere e guidare efficacemente i nostri sforzi nel campo della salute. La raccolta di tali informazioni sulla popolazione nei suini è sempre stata problematica perché i segni clinici sono molto variabili e il campionamento individuale è costoso; tuttavia, l'uso dei fluidi orali ci offre un'alternativa facile, efficiente ed economica per il monitoraggio epidemiologico.

I fluidi orali si ottengono da un suino o da un gruppo di suini semplicemente appendendo una corda di cotone nel box affinché possano mordere / masticare e quindi recuperare il fluido orale dalla corda bagnata. Più di 27 agenti patogeni, tra cui la peste suina africana (PSA), la peste suina classica (PSC), l'afta epizootica, il circovirus suino (PCV), la sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRS), producono livelli rilevabili di acidi nucleici e / o anticorpi specifici nei fluidi orali. Oggi, questo tipo di campionamento è comunemente utilizzato negli Stati Uniti per monitorare le popolazioni di suini. Ad esempio, il laboratorio diagnostico veterinario della Iowa State University ha elaborato circa 1,4 milioni di campioni di fluidi orali tra il 2010 e il 2019.

Cominciando dall'inizio:

1. Qual è il mio obiettivo sanitario a lungo termine? In che modo il monitoraggio mi aiuterà a raggiungere questo obiettivo?
2. Comprendi il procedimento della raccolta dei fluidi orali : Ci sono molti video online che descrivono come e perché prelevare campioni di fluidi orali..

Prelievo di fluidi orali:

1. Organizza i materiali: Disporre di corde, forbici, sacchetti, provette ecc...per ogni reparto. Mantenere la biosicurezza ed evitare di trasportare materiali da un capannone all'altro.
2. Prelevare campioni la mattina presto: i suini sono più attivi nelle prime ore del mattino. Raccogli i campioni prima di dar loro da mangiare.
3. Usa la “psicologia” suina: La prima volta, permetti loro di interagire con la corda appesa abbastanza a lungo da esplorare e imparare il procedimento (circa 45 minuti). Se i suini sono indifferenti, lanciare a terra un metro di corda con nodi alle estremità per circa 30 minuti. Una volta che iniziano a giocarci, trascina la corda guidando lentamente i suini nel luogo prescelto e appendi una nuova corda per farli masticare. Ricordatevi che l'uso di aromi o dolcificanti sulla corda ha offerto pochissimi vantaggi nella pratica.
4. Quali soggetti campionare? I suinetti prima dello svezzamento vengono campionati raccogliendo i fluidi orali familiari (scrofe e suinetti). È possibile raccogliere liquidi orali singoli o di box da suini di età ≥ 21 giorni, comprese le scrofe alloggiate in gruppo. I fluidi orali possono essere raccolti da verri e scrofe alloggiate individualmente, ma richiede addestramento (vedere # 3) e generalmente non è pratico nei grandi sistemi commerciali.
5. Segui una routine: Appendi la corda nello stesso punto, alla stessa ora del giorno per stabilire una routine. I suini impareranno rapidamente il procedimento e sapranno esattamente cosa fare nel successivo campionamento. Una volta stabilito un modello, il tempo di raccolta può essere ridotto a 20 minuti. Non lasciare la corda nel box per un periodo di tempo prolungato (ore) perché (a) il campione andrà perso nel tempo man mano che la fune si asciuga; (b) i suini sono forti e distruggeranno la corda se gli viene dato abbastanza tempo; (c) i suini si annoiano con la corda e semplicemente la ignorano.
6. Evita l'eccesso di contaminazione del campione: Posizionare la corda in modo che sia all'altezza delle spalle dei suini, evitando che tocchi il pavimento. La materia organica non influisce direttamente sui test diagnostici (RT-PCR o ELISA), ma minore è la materia organica contenuta nel campione, più facile è il processamento in laboratorio.
7. Utilizzare un sacchetto e una provetta puliti per ogni campione: Mettete la parte bagnata della corda in un sacchetto di plastica, strizzatela e raccogliete il liquido nella provetta pulita che verrà inviato al laboratorio (precedentemente etichettata). Rimuovere le corde dai box dopo ogni campionamento per mantenere la novità (anche i suini si annoiano!)
8. Conserva il campione: Raffreddare il campione (4 ° C) mettendolo su ghiaccio o in frigorifero subito dopo il campionamento. I calcoli basati sui dati di Prickett et al., (2010) stimano un'emivita dell'RNA del PRRSV nei fluidi orali di circa 13 ore a 30 ° C, 42 ore a 20 ° C e 14 giorni a <10 ° C. Gli anticorpi contro il PRRSV non sono stati rilevati dopo 72 ore a 30 ° C.

Fluidi orali per programmi di monitoraggio:

1. Quanti campioni devo prelevare e con quale frequenza? Dobbiamo tutti attenerci a un budget. Anche così, pochi campioni, da 2 a 4 corde per capannone (o reparto), a determinati intervalli (2-4 settimane), insieme agli indici produttivi, ci forniranno un resoconto eloquente dello stato sanitario dell'allevamento (grafico 1 ).
2. Prepara un piano per valutare costantemente le informazioni: Una buona alternativa sono i diagrammi di controllo del processo o SPC.
3. Utilizzare il "campionamento spaziale fisso" per massimizzare il rilevamento all'interno del capannone: una spiegazione pratica di questa metodologia può essere trovata online
   1. Prelievo di fluidi orali (in Inglese).
   2. Prelievo di fluidi orali (in Spagnolo).
4. Aspetta l'inaspettato: Avere un piano per verificare o escludere risultati diagnostici imprevisti. Ad esempio: ripetere il test degli stessi campioni in duplicato, ricampionare i suini, analizzare utilizzando un altro metodo, ecc...
5. Ricorda l'evoluzione naturale delle malattie per stabilire un piano. I test degli acidi nucleici rileveranno la presenza precoce del virus, mentre i test degli anticorpi rileveranno la risposta immunitaria prolungata risultante. Le due tecnologie funzionano meglio insieme per il monitoraggio, ad esempio, per autorizzare l'uscita di soggetti dalla quarantena.

Altre considerazioni:

1. Zebre e cavalli ... cose simili non sono sempre uguali: I campioni che possono apparire simili ai fluidi orali (p. Es., Tamponi orali o nasali) potrebbero non fornire lo stesso tasso di rilevamento. Nella tabella 1 sono riportati esempi di influenza A, afta epizootica, Senecavirus A e PRRSV.
2. Non mescolare (pool) fluidi orali e non spostare le corde da un box all'altro: Invece di migliorare il tasso di rilevamento, questi processi possono creare falsi negativi.
3. Evitare il congelamento e lo scongelamento dei campioni o sbalzi di temperatura: Gli anticorpi nei fluidi orali sono abbastanza resistenti, ma gli acidi nucleici non sono così resistenti. Dividi il campione in più frazioni se hai bisogno di più test. In allevamento, non conservare i campioni nei congelatori NoFrost, visti i loro cicli fluttuanti di sbrinamento automatico. In laboratorio, scongelare i campioni in frigorifero (4 ° C) e non a temperatura ambiente. Queste pratiche hanno mostrato una migliore conservazione degli acidi nucleici (Weiser et al., 2018).

Tabella 1. Confronto della rilevazione degli acidi nucleici nei fluidi orali rispetto ai tamponi orali o nasali

nd = nessun dato.

^aTasso di positività stimato (medio) per fluidi orali raccolti nei box rispetto a tampone orale o nasale. Dati tratti da Hole et al., (2019); Pepin et al., (2015); Romagosa et al., (2012); Senthilkumaran et al., (2017)