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La reazione a catena della polimerasi (PCR polymerase chain reaction) è uno degli strumenti diagnostici più comuni utilizzati oggi dai veterinari di produzione suina. Viene utilizzato non solo per scopi diagnostici, ma anche per migliorare la biosicurezza attraverso la sorveglianza ed il controllo delle malattie. Pertanto, è fondamentale comprendere i vantaggi e gli svantaggi di tale tecnologia durante l'interpretazione dei risultati. È anche importante ricordare che anche se la stessa tecnologia viene utilizzata per agenti patogeni diversi, dovrebbero esserci differenze nell'interpretazione di questi risultati.
Informazioni del test
La PCR è progettata per la rilevazione di materiale genetico (DNA o RNA) da batteri o virus. Il processo inizia con l'estrazione di DNA o RNA dal campione, che viene successivamente sottoposto a cicli di amplificazione termica. Se il materiale estratto è RNA, il primo passo sarà convertire l'RNA in DNA (tecnicamente noto come DNA complementare o cDNA). I cicli termici consistono in un processo in 3 fasi: 1) denaturazione, 2) allineamento e 3) estensione, in cui si ottiene come risultato la duplicazione del DNA presente nel campione. Pertanto, per ogni ciclo (1 Ct), assumendo un'efficienza del 100%, sarà presente il doppio del DNA. L'obiettivo è continuare il processo di amplificazione fino a quando non viene rilevato abbastanza DNA per rendere il campione positivo o fino a 30-40 cicli, a seconda del modello di test specifico utilizzato.
Il processo di estrazione è una fase critica del test PCR, poiché influisce sulla quantità e qualità del materiale genetico nel campione analizzato. È essenziale utilizzare il processo di estrazione appropriato per il tipo di campione da analizzare (siero, fluidi orali, tessuti, ecc.). Il passaggio 2 del processo di amplificazione (allineamento) richiede l'uso di primers, che sono brevi frammenti di sequenza di DNA specificamente progettati per legarsi e aiutare a replicare la specifica sequenza genetica dell'agente patogeno in questione. Per i patogeni che sono in continua evoluzione genetica (come il virus della PRRS), questi primers devono essere aggiornati regolarmente per garantire che i nuovi ceppi continuino ad essere rilevati.
La soglia del ciclo del test (di solito intorno a 30-40) viene stabilita determinando che se il processo di amplificazione dovesse continuare, il test sarebbe in definitiva positivo a causa dell'allineamento e dell'estensione spontanei. Questo suggerisce che i risultati positivi deboli, con valori Ct elevati vicino alla soglia, richiedono una considerazione speciale nell'interpretazione dei risultati, specialmente alla fine di un focolaio.
Esistono due diversi usi dei test PCR nella medicina veterinaria dei suini. La tradizionale PCR in gel e la più moderna PCR in tempo reale. Entrambi i test funzionano allo stesso modo, in base all'amplificazione del DNA o dell'RNA. La differenza è che la PCR su gel viene "letta" solo una volta alla fine del test, mentre i risultati del test PCR in tempo reale vengono "letti" dopo ogni ciclo. Il vantaggio della PCR in tempo reale è che consente di ottenere risultati quantitativi/semi-quantitativi.
I pool di campioni per l'analisi
I test PCR hanno un'elevata capacità di rilevare piccole quantità di materiale genetico nei campioni (sensibilità analitica) grazie al processo di amplificazione, che offre la possibilità di analizzare più campioni con un unico test (pooling o raggruppamento). È importante ricordare che il pooling, per definizione, diluirà il campione analizzato. Questo non dovrebbe essere un problema quando la concentrazione prevista di un determinato agente patogeno è elevata (soprattutto all'inizio dell'epidemia). Tuttavia, il raggruppamento può essere un problema quando la concentrazione dell'agente patogeno in un campione positivo è bassa, ad esempio alla fine di un'epidemia o in un tipo di campione che dovrebbe essere diluito (fluidi orali).
