Importanza delle prove diagnostiche correlate con il PCV2

Dovuto all'elevata prevalenza dell'infezione da PCV2 e della sua presenza sia in animali sani che ammalati, si discute sul valore delle prove sierologiche nei confronti di questo agente come elemento diagnostico. E' risaputo che la diagnosi di circovirosi si deve basare sui criteri di Sorden. Senza dubbio, queste prove presentano un interesse in funzione del tipo di analisi, della sua disponibilità e delle circostanze o condizioni con cui si intende utilizzare oltre l'obiettivo delle analisi stesse.

Il fatto che l'immunofluorescenza indiretta (IFA) non si utilizzi dalle nostre parti, e che la prova di immuno perossidasi su monostrato (IPMA) sia ristretta praticamente all'ambito scientifico, data la sua onerosità e limitata disponibilità, queste tipologie di analisi non saranno trattate in questa breve revisione. E' importante notare però, che per alcuni esperti, quest'ultima sarebbe una delle prove di riferimento con la quale si valutano le prove immunoenzimatiche o ELISAs.

ELISA

Nell'ambito delle prove ELISA alla nostra portata, possiamo trovare due grandi gruppi:

• Le prove di blocco, il cui oggetto è la determinazione delle immunoglobuline IgM e IgG.
• Le prove indirette o destinate a rilevare gli anticorpi totali.

ELISAs di blocco

Oggi sono disponibili kit commerciali che risultano di grande utilità nelle seguenti condizioni:

• Determinazione del periodo d'infezione e della circolazione virale, sempre e quando gli animali non siano vaccinati o benchè siano stati applicati vaccini che diano una risposta di poca entità o non rilevabili alla prova.
• La correlazione tra il livello (0 % di animali con risposta positiva) di IgM e IgG è indicativo del momento iniziale dell'infezione o circolazione virale ( Figura 1).

Figura 1.- Evoluzione della risposta con IgGs e IgMs misurate con ELISA di blocco (INGENASA) e della viremia da PCV2 dopo un challenge esperimentale (Segalés et al. 2005)

Le IgM si rilevano da 7-14 giorni post-infezione, una settimana prima delle IgG. A 3 settimane p.i. la sieroprevalenza è similare. Mentre le IgG rimangono , le IgM scompaiono. La distanza relativa tra loro indica l'intervallo di tempo trascorso dopo l'infezione.

• Accompagnamento della circolazione virale nei lotti, sia nella sua forma clinica che subclinica (Fig 2).

Figura 2.- Sieroprofilo trasversale di un allevamento colpito da circovirosi clinica in assenza di vaccinazione.

Allevamento con problemi di PMWS a partire dalla 10° settimana di vita. Gli anticorpi totali danno un'idea dell'immunità materna, per prima cosa, e la sieroconversione post-infezione. I vari lotti di età possono avere avuto l'infezione in momenti leggermente distinti. Per interpretare questo grafico, conviene osservare la figura 1.

Ovviamente, dobbiamo essere cauti nel momento di interpretare i risultati, come si è detto, l'infezione non sempre corrisponde a malattia, sopratutto se in presenza di vaccinazione. D'altra parte, dovuto all'elevata prevalenza di PCV2, queste prove presentano poco interesse in scrofe adulte, restringendosi normalmente l'utilizzo a suinetti in svezzamento ed ingrasso.

ELISAs indiretti

In quanto alle prove degli anticorpi totali, ci sono varie disponibilità commerciali o offerte da parte di laboratori di analisi. La loro utilità si può trovare nella (Figura 2):

• Monitoraggio della evoluzione dell'immunità materna ed eventuale studio dell'interferenza da parte della stessa.
• Come complemento della prova IgG/IgM nei sieroprofili.
• Valutazione dello stato immunitario delle scrofe e dei suinetti (colostratura).
• Eventualmente, valutazione della qualità della vaccinazione¹, in funzione del tipo di vaccino utilizzato e del tipo di kit diagnostico impiegato (Figura 3).

Figura 3.- Sieroprofili trasversali in suinetti vaccinati nei confronti del PCV2 allo svezzamento: risposta comparativa in due prove ELISA indirette per anticorpi totali.

La risposta delle IgG indica evoluzione degli anticorpi di origine materna e/o sieroconversione di corta durata dopo la vaccinazione. Le IgM permangono a livelli basali per assenza di infezione. Le prove indirette si comportano in maniera distinta, mentre la di tipo A corrisponde a immunità materna prima e a risposta debole al vaccino, a partire dalle 12 settimane; la B sarebbe più sensibile indicando in modo piu preciso la risposta alla vaccinazione. Ovviamente, misurano anticorpi distinti.

Relativamente a queste prove, conviene chiarire che non sono correlate con il grado di protezione in animali vaccinati, dato che ci sono vaccini che non danno risposta ad alcuna di queste prove o la risposta è irregolare senza voler dire che non ci sia protezione.

D'altra parte, è normale incontrare risultati differenti in prove commerciali differenti (Aleff et al. 2007). Così è possibile per esempio mentre una prova dà risultati deboli o inconsistenti, un'altra permette di misurare perfettamente la risposta vaccinale (Figura 3). Fino a quando uno non è cosciente di queste possibilità, possiamo essere indotti ad errate interpretazioni. Al contrario, una buona conoscenza delle prove sierologiche, associata al loro uso corretto può essere di gran aiuto per conoscere la situazione epidemiologica o vaccinale ed applicare misure efficaci. In qualsivoglia caso, nel momento di interpretare una sierologia è consigliabile un buon schema di campionamenti, la conoscenza dell'anamnesi degli animali da cui prelevare campioni e consultare una persona con esperienza nell'uso ed interpretazione di ogni test utilizzato.

Alla fine, conviene ribadire che comunque spesso parliamo di “titoli” e la maggior parte di queste prove sono di tipo “qualitativo”, cioè che valori al di sopra di una soglia si considerano positivi e quelli che stanno sotto detta soglia si considerano negativi , e pertanto tentare di fare una valutazione quantitativa degli stessi può risultare frustrante o perlomeno confuso. Come alternativa, alcuni fornitori propongono di realizzare le analisi degli stessi campioni in vari "pozzetti" arrivando ad un risultato “semiquantitativo” mediante un calcolo matematico adeguato. Altri elaborano un valore proporzionale o indice, a volte chiamato S/P rapporto calcolato come “correlazione tra il valore di lettura del campione e il controllo positivo una volta dedotto da entrambi il valore del controllo negativo ”. Altre volte si compara la lettura del "pozzetto" con una scala prefissata di valori di controllo positivi e a volte si applica alla lettura di densità ottica del "pozzetto" una formula matematica per assegnar loro una titolazione che normalmente è stata elaborata facendo analisi in parallelo con una prova di referenza (Segalés et al 2011). Pertanto, bisogna essere prudenti nel momento in cui si stabiliscono delle conclusioni basate su risultati quantitativi, anche se secondo il metodo di ottenimento ed ai fini della valutazione potrebbero essere in certe occasioni d'aiuto.

¹ E' stato sviluppato un ELISA specifico per comprovare la qualità della vaccinazione nei confronti di uno dei vaccini commerciali basati sulla risposta anticorpale nei confronti del baculovirus vaccinale.